Physiopathologie et thérapies des maladies mitochondriales

L’équipe est constituée depuis le premier janvier 2005 autours de 4 thèmes de recherches majeures visant tous à progresser vers la thérapie des maladies mitochondriales à travers une meilleure compréhension des mécanismes qui les sous-tendent.

Les maladies mitochondriales réunissent un ensemble extraordinairement varié de pathologies qui surviennent depuis la vie intra-utérine jusqu’à la fin de la vie. La génétique de ces maladies est rendue complexe par la double origine génétique des composants des mitochondriaux, codés soit par des gènes nucléaires, soit par les gènes portés par l’ADN mitochondrial.   Du fait du (des) rôle(s) majeure(s) joué par les mitochondries dans toutes les cellules de l’organisme, les atteintes concernent tous les organes, isolément ou en association. Au premier plan des atteintes les plus fréquentes et les plus graves figurent les atteintes neurologiques cérébrales, justifiant pleinement notre rattachement à l’Unité 676 de l’INSERM nouvellement crée, qui réunit des compétences permettant d’aborder différents aspects de la pathophysiologie du cerveau en développement.

Structure et fonction des mitochondries ont donné lieu à des études considérables dans les années 1950-1970 permettant une description détaillée de celles-ci. La fin du siècle dernier a vu les études génétiques et moléculaires permettrent des avancées considérables dans le domaine des maladies impliquant ces organites cellulaires, sans pour autant répondre à l’attente majeure des familles d’une (de) thérapie(s) de ces maladies. Ce dernier aspect constitue désormais un défit majeur qui justifie la constitution de notre équipe de recherche.

L’étude et l’utilisation du modèle de souris Harlequin
(The Harlequin mouse, a model for understanding and treating mitochondrial complex I-related disease)

Les mitochondries jouent un rôle essentiel dans la production de l’énergie cellulaire à travers la phosphorylation oxydative, processus qui engage les cinq complexes multi-protéiques de la chaîne respiratoire. La NADH :ubiquinone oxydoréductase (complexe I) est un très gros complexe de plus de 45 sous-unités qui catalyse le transfert d’électrons entre le NADH formé dans la matrice mitochondriale et le pool d’ubiquinone de la chaîne respiratoire. Les déficits en complexe I représentent plus de 30% des déficits de la chaîne respiratoire chez l’homme et constituent par conséquent les cytopathies mitochondriales les plus fréquentes. Le spectre clinique des patients déficitaires en complexe I inclut: syndrome de Leigh, retard de croissance, rétinite pigmentaire, atrophie optique progressive, ataxie cérébelleuse et cardiomyopathie hypertrophique. Le caractère progressif de ces symptômes laisse envisager qu’on puisse en entraver la dramatique évolution, mais à ce jour, et malgré les grandes avancées auxquelles nous avons assisté dans la compréhension des bases moléculaires des déficits en complexe I de la chaîne respiratoire chez l’homme, aucune réelle thérapie ne peut être proposée. Cela provient clairement du fait que les évènements cellulaires associés au déficit en complexe I sont encore mal compris. Le peu d’avancées dans ce domaine s’explique notamment par l’absence de modèle animal crédible de déficit en complexe I de la chaîne respiratoire. Dans ce contexte, nous avons récemment établi que la souris Harlequin (Hq) présente un déficit sévère en complexe I de la chaîne respiratoire, offrant pour la première fois la possibilité d’étudier les mécanismes cellulaires associés au déficit du complexe I et d’entreprendre des études thérapeutiques. La souris Hq a d’abord été décrite comme un mutant spontané lié au chromosome X avec des anomalies apparentes du pelage. Depuis, il a été montré plus récemment qu’elle présentait également une atrophie optique,une rétinite pigmentaire, une ataxie cérébelleuse et un retard de croissance, caractéristiques très proches des symptômes cliniques observés chez les patients déficitaires en complexe I. Le phénotype Hq est lié à une insertion provirale dans le gène codant pour AIF (Apoptosis-Inducing Factor), dont l’expression se trouve réduite d’environ 80%. AIF est une protéine de l’espace intermembranaire mitochondrial susceptible, après relargage dans le cytosol, d’induire l’apoptose indépendamment de la voie des caspases ; la compréhension des propriétés apoptogéniques d’AIF a ainsi suscité un grand nombre d’études ces dernières années. Cependant, l’inhibition d’AIF induit aussi un stress oxydatif dont nous avons montré récemment qu’il était associé à un profond déficit en complexe I, faisant le lien entre le phénotype Hq et les déficits de la chaîne respiratoire mitochondriale. L’objectif de notre projet est de tirer parti de la souris Hq à la fois pour caractériser les conséquences d’un déficit en complexe I, et pour engager parallèlement des essais thérapeutiques par approches pharmacologique et génique destinées à entraver le processus dégénératif et l’ataxie in vivo. Les critères comportementaux, histo-morphologiques et biochimiques de la souris Hq seront étudiés en détail et utilisés pour évaluer les effets potentiels d’une série de molécules. Parallèlement, le gène de S. Cerevisiae codant pour la NADH-quinone oxydoréductase interne roténone-insensible, dont il a récemment été montré qu’elle pouvait compenser la fonction de transfert d’électron du complexe I à la fois ex vivo dans des cellules humaines et in vivo chez les rongeurs, sera utilisé comme outil thérapeutique pour remplacer le complexe I déficitaire dans la souris Hq.

L’étude du contrôle de la prolifération et de la mort cellulaire par les voies mitochondriales à travers l’étude de la tumorigenèse induite par le déficit en succinate déshydrogénase

Notre équipe travaille depuis des années sur les maladies mitochondriales de l’enfant. En 1994 nous montrions pour la première fois l’implication d’un déficit dans un des gènes d’une enzyme du cycle de Krebs, la fumarase, dans des encéphalopathies gravissimes de l’enfant. Forts de cette première découverte, dès 1995 nous avons pu identifier une autre enzyme du cycle de Krebs, la succinate deshydrogénase dont un déficit d’origine génétique provoque les mêmes syndromes chez les patients.

Bien plus tard en 2000 et 2002, deux équipes, travaillant l’une sur des paragangliomes et des  pheocromocytomes, l’autre sur des leiomyomes, fibromes et cancers du rein ont mis en évidence des phénomènes de perte d’hétérozygotie avec les gènes de ces deux même enzymes. En 2001 au travers d’une collaboration avec l’équipe de Xavier Jeunemaître, nous avons montré que la formation de tumeurs provoquées par la perte d’hétérozygotie d’un des gènes de la succinate deshydrogénase conduisaient à une augmentation de l’expression de facteurs angiogéniques. Depuis, bien des chercheurs ont formulé différentes hypothèses pour expliquer le lien entre la formation de tumeurs et leur origine métabolique, mais peu si ce n’est aucune preuve scientifique n’a été à ce jour publiée. Ce n’est qu’il y a quelques mois que nous avons mis en évidence les premiers éléments permettant d’expliquer la formation de ces tumeurs.

C’est en étudiant les cellules des patients exprimant ces déficits enzymatiques que nous avons pu établir un premier lien entre une accumulation d’acides organiques liée au déficits et l’accumulation d’une protéine caractéristique de hypoxie, HIF-1 alpha. HIF-1 alpha est un facteur de transcription normalement induit dans les cellules non cancéreuse par une hypoxie, mais dont l’induction non controlée par la cellule conduit à la formation de tumeur et à leur vascularisation. Dans le même temps nous avons trouvé les conditions de culture permettant l’apparition de prolifération anormale de fibroblastes déficitaire pour la succinate deshydorgénase, justifiant l’étude de telles cellules. Nous disposons donc, pour l’instant de deux outils solides pour l’étude de la formation de ces tumeurs : l’observation en immunocytométrie de l’accumulation du facteur de transcription HIF-1 alpha qui constitue l’étape primaire de la formation de la tumeur et les proliférations cellulaires en culture qui fournissent un modèle d’étude du processus tumoral déjà enclenché.

L’accumulation des acides organiques est directement liée aux déficits enzymatiques eux même conséquences de mutations génétiques touchant les protéines qui les constituent. L’accumulation du facteur de transcription HIF-1 alpha est due à une inactivation de la prolyl hydroxylase PHD4 dont l’activité conduit normalement à la destruction de HIF-1 alpha.

De l’accumulation d’acides organiques à l’inhibition de la PHD4, nous pouvons dessiner trois chemins possibles : cette prolyl hydroxylase ne peut catalyser sa réaction qu’en oxydant une molécule d’alphacétoglutarate en succinate, ce dernier, présent à très forte concentrations dans le cytoplasme des cellules déficitaires est susceptible de venir inhiber la PHD4 par effet de produit. Les deux types de déficits, fumarase ou succinate deshydrogénase conduisent in vitro à des déficits du complexe II de la chaîne respiratoire. Le complexe II est la seul deshydrogénase capable de maintenir un niveau élevé de réduction du pool de quinones mitochondriales ce qui protège la cellule d’un relargage trop important de superoxides potentiellement capables d’inhiber la PDH4. Enfin, les différents acides organiques sont tous des chélateurs du fer qui participe aussi au bon fonctionnement de la PHD4. La concentration cytoplasmique de fer libre pourrait être décisive dans l’inhibition de l’enzyme comme c’est d’ailleurs le cas dans la tumorigénèse liée au cobalt. Chacune de ces hypothèses sera l’objet de différentes expériences qui permettront d’affirmer ou d’infirmer nos hypothèses en observant en immunocytométrie l’accumulation de HIF 1 alpha, on ne négligera pas la possibilité d’une action cumulative de chacune de ces réactions.

Par le passé, la compréhension de certains mécanismes délétères dans le cas de l’ataxie de Friedreich comme dans le cas de déficit profond en coenzyme Q10 nous a permis de proposer directement aux malades des solutions thérapeutiques efficaces.  C’est dans cet optique que l’on peut attendre des options thérapeutiques qui pourront être directement testées sur les proliférations obtenues en culture. En effet le fait que les conséquences de ces déficits conduisent, lorsqu’ils sont constitutionnels, certaines cellules de patients vers la mort cellulaire, permet d’espérer qu’en annulant l’accumulation de HIF-1 alpha et donc en faisant disparaître les processus prolifératifs, on plongera la cellule vers un processus de mort et donc une destruction spécifique de la tumeur.

Notre projet est donc de comprendre le processus biochimique qui conduit à la formation de la tumeur et de tester les drogues susceptibles de bloquer ce processus et de tourner spécifiquement les cellules tumorales vers une mort cellulaire.

L’étude et l’utilisation des modèles cellulaires de déficits de la chaîne respiratoire

Dans le cadre du projet Européen Eumitocombat (http://), un ensemble de travaux destines à mieux caractériser l’importance du stress pro-oxydant dans des cellules en culture déficitaires en complexe I de la chaîne respiratoire sera entrepris. Il s’agit là d’une part de quantifier les dégats et les réponses cellulaires entraînés par le stress éventuel, mais également dans un second temps d’identifier des molécules d’intérêt permettant de protéger les cellules déficitaires. Les molécules identifiées pourront dans un second temps être testées sur le modèle murin Hralequin également déficitaire en complexe I.

En parallèle, nous tentons, soutenus en cela par l’AFM d’introduire dans des cellules humaines une protéine permettant d’établir à elle seule, voir de rétablir, un flux d’électrons actifs entre les substrats respiratoires et l’oxygène (court-circuitant près d’une cinquantaine de protéines). L’enjeu essentiel à la clé est une meilleure compréhension du rôle de la baisse de la production d’ATP dans les déficits de la chaîne respiratoire, cette protéine ne générant par de gradient électrochimique lors du transport d’électrons.

L’identification de nouvelles molécules pour combattre l’Ataxie de Friedreich

L’ataxie de Friedreich résulte d’une expansion de triplets dans le premier intron du gène codant pour la frataxine et est associée à une diminution de l’expression de cette protéine. Nous avons montré en 1997 qu’il s’en suit une altération des fonctions mitochondriales caractérisée par un déficit généralisé en protéines à centre Fer-Soufre. Les conséquences sont une surcharge tardive en fer dans les mitochondries et une série d’atteintes oxydatives dont nous avons montré qu’on pouvait les bloquer par des antioxydants comme l’idébénone. In vivo, cependant, l’effet de la drogue reste partiel (essentiellement efficace contre la cardiomyopathie) et l’urgence réside dès lors dans la mise au point d’autres thérapies. Dans le but de progresser rapidement, nous avons besoin de modèles cellulaires et animaux fiables, plus proches de la maladie que le système initial utilisé pour découvrir l’idébénone.

 Malgré le caractère ubiquitaire (même si variable) de l’expression de la frataxine dans les cellules et tissus humains, la maladie implique principalement le système nerveux et le cœur, le diabète n’étant qu’occasionnellement associé. D’ailleurs, les lymphocytes circulants, les lignées lymphoblastoïdes et les fibroblastes cutanés en culture ne révèlent aucune altération significative de l’activité de leurs protéines Fer-Soufre. Il en résulte que les prélèvements faciles d’accès chez l’homme ne constituent en aucun cas un modèle d’étude raisonnable pour l’Ataxie de Friedreich.

 Nous avons participé à la caractérisation de modèles animaux (essentiellement murins) de cette maladie depuis plusieurs années en collaboration suivie avec nos collègues de Strasbourg. Cependant tous les modèles disponibles à ce jour diffèrent de la situation humaine par le fait que les tissus ciblés chez la souris n’expriment plus du tout de frataxine. Bien que ces modèles aient été assez performants pour élucider les aspects fonctionnels de la frataxine, leur inconvénient majeur est de mimer une situation extrême où la chaîne respiratoire des cellules ciblées n’est plus du tout fonctionnelle, rendant peu réaliste le test de drogues.

 Plus récemment, le groupe de Roland Lill en Allemagne, a utilisé avec succès l’approche « silencing RNA » (siRNA) pour réduire transitoirement l’expression de la frataxine dans des cellules HeLa. Pour la toute première fois, un modèle de cellules humaines reproduisant les caractéristiques biochimiques de la maladie avec un déficit partiel significatif en protéines Fer-Soufre. Ces cellules ont pu être manipulées pour appréhender le lien spécifique entre le déficit en protéines Fer-Soufre et la diminution du taux de frataxine mais non pas pour tester de potentielles drogues.

 Un de nos objecifs est d’obtenir, de caractériser et d’utiliser pour identifier des drogues, un modèle cellulaire humain crédible de l’ataxie de Friedreich, grâce à la technologie des siRNA, mais à l’aide d’un vecteur d’expression stable des ARN ciblant la frataxine. Nous tenterons de réduire l’expression de la frataxine dans la lignée HeLa au moyen de siRNA ciblés contre la frataxine. Ces siRNA seront sélectionnés avec le concours du groupe de Roland Lill en Allemagne qui a accepté de partager son expérience avec nous sur ce point. Cependant, contrairement à son travail préliminaire, nous utiliserons des vecteurs commerciaux permettant une expression inductible et stable des siRNA.

Caractérisation du modèle cellulaire

On a montré que le déficit en frataxine induit un déficit de la chaîne respiratoire dans le cœur des patients FRDA, essentiellement via un déficit en protéinrs Fer-Soufre. En utilisant tout l’éventail de méthodes d’investigation des fonctions mitochondriales mises au point dans notre équipe, nous étudierons dans un premier temps, sur les plans qualitatif et quantitatif, le déficit de la chaîne respiratoire associé à l’extinction de la frataxine dans les cellules en culture. Des mesures de la respiration cellulaire et de l’oxydation spécifique de substrats mitochondriaux seront également réalisées par la méthode de polarographie, dans le but de détecter de potentielles perturbations de la phosphorylation oxydative. Les conséquences physiologiques de la perturbation des fonctions mitochondriales seront étudiées en suivant les niveaux d’ATP dans la cellule. Après perméabilisation des cellules au moyen de détergents, l’oxydation des substrats mitochondriaux sera étudiée pour évaluer la capacité des mitochondries à métaboliser spécifiquement divers substrats. Ces études polarographiques pourraient par exemple mettre en évidence une perte de cytochrome c dont le relargage dans le cytosol est associé au déclenchement du processus apoptotique.

 Les analyses spectrophotométriques permettront d’étudier en détail une potentielle perte d’activité d’enzymes mitochondriales dans notre modèle cellulaire. Il faut souligner que le FRDA est associé à un déficit qui touche spécifiquement les protéines Fer-Soufre, en tout cas chez l’homme, et qu’un modèle réaliste se doit de reproduire cette caractéristique. On compte des protéines Fer-Soufre dans la structure des complexes I, II et III de la chaîne respiratoire et l’aconitase, enzyme du cycle de Krebs est également une protéine à centre Fer-Soufre. L’activité de toutes les enzymes susceptibles d’être touchées dans le Friedreich seront mesurées grâce à plusieurs marqueurs enzymatiques mitochondriaux (citrate synthase, fumarase, NADP-isocitrate dehydrogénase) et par la mesure de l’activité d’autres composants dela chaîne respiratoire (C IV, C V). Cela devrait permettre de valider la fiabilité de notre modèle afin de passer à l’étape de test de potentielles molécules protectrices.

Tester les drogues

Comme d’autres groupes, nous avons déjà établi que l’une des conséquences du déficit en protéines Fer-Soufre dans la mitochondrie est l’augmentation de la mort cellulaire en culture. Plus récemment, nous avons également montré que le défaut d’activité de l’aconitase résulte lui aussi d’une mort cellulaire accrue. De notre longue expérience dans l’établissement de milieux de cultures sélectifs vis-à-vis de la chaîne respiratoire, nous pouvons prédire que le phénotype de mort cellulaire associé au déficit mitochondrial induit par le déficit en frataxine poura être utilisé pour tester des drogues. Par ailleurs, toute autre thérapie pourra être testée sur notre modèle cellulaire que nous laisserons à la disposition de la communauté scientifique sur une base collaborative.

Après l’établissement de ce modèle fiable de l’ataxie de Friedreich dans des cellules HeLa, nous tenterons d’obtenir un modèle semblable à partir d’une lignée dérivée des cellules pré-neuronales NT2. Etant donné que la spécificité tissulaire/cellulaire semble jouer un rôle central dans la maladie (comme dans la plupart des maladies mitochondriales), l’établissement de ce second modèle pourrait être d’un apport appréciable dans le contexte de l’ataxie de Friedreich.